甲型流感H1N1亞型IAV-H1N1熒光PCR試劑盒說明書

【產(chǎn)品名稱】

商品名稱：甲型流感病毒 H1N1 (IAV-H1N1) 核酸檢測試劑盒 (熒光-PCR 法)

Name ：Influenza A virus subtype H1N1 Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】48T/盒

【預期用途】

甲型流感H1N1是一種RNA病毒，屬于正黏液病毒科。它的宿主是犬科動物、鳥類和一些哺乳動物。幾乎所有甲型的 H1N1 病毒已被隔離，野生鳥類出現(xiàn)疾病屬罕見。有些 H1N1 病毒引起嚴重的疾病大多發(fā)生于家禽和寵物方面，而人類卻很少出現(xiàn)。但經(jīng)過鳥類和犬科動物為主的哺乳動物的傳播和變異，這可能導致疫情或人類流感大面積傳播。

本試劑盒適用于檢測鼻咽拭子、氣管分泌物等標本中的甲型流感病毒 H1N1RNA，適用于甲型流感病毒 H1N1 型感染的輔助診斷及流行病學調(diào)查。

【檢驗原理】

本試劑盒根據(jù)甲型流感病毒 H1 型 HA 基因、N1 型的 NA 基因分別設(shè)計的特異性引物和熒光探針[1-3]，用一步法熒光 RT-PCR 技術(shù)對甲型流感病毒 H1N1 RNA 進行體外擴增檢測，用于臨床上對可疑感染者的病原學診斷。

【試劑組成】

注：

1）不同批號試劑不能混用。

2）試劑盒內(nèi)各試劑組份足夠包裝規(guī)格所標示的檢測次數(shù)。

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復凍融次數(shù)不超過5次，有效期9個月。

【適用儀器】

ABI 7300、7500、ABI stepone / stepone plus、安捷倫 MX3000P/3005P、MJ Opticon2、Eppendorf 2/4 Color Systems、Bio-RadCFX96 等熒光定量PCR檢測儀。

【標本采集】

患病動物：鼻咽咽拭子、氣管分泌物；血液：用一次性無菌注射器抽取靜脈血

2mL。

【保存和運輸】

上述標本短期內(nèi)可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過 6 個月，標

本運送應采用 2~8℃冰袋運輸，嚴禁反復凍融。

【使用方法】

1. 樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1樣本前處理

鼻咽棉拭、氣管分泌物取 100μl。血液樣品，3000rpm 離心 5min，吸取 100μL 上層血清，轉(zhuǎn)移至 1.5mL 滅菌離心管

1.2RNA 提取

推薦采用上海晅科生物科技有限公司生產(chǎn)的 RNA 提取試劑盒（離心柱提取法），請按照試劑盒說明書進行操作。

2. 試劑配制（試劑準備區(qū)）

根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設(shè)所需要的 PCR 反應管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照；樣品每滿 7 份，多配制 1 份)，每測試反應體系配制如下表：

將混合好的測試反應液分裝到 PCR 反應管中，21uL/管。

3. 加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟 1 提取的 RNA、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μL，分別加入相應的反應管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。

4. PCR 擴增（核酸擴增區(qū)）

4.1 將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內(nèi)；

4.2 設(shè)置好通道、樣品信息，反應體系設(shè)置為 25μL；熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye）FAM、ROX， 淬滅通道（Quencher Dye）選擇 NONE，

請勿選擇 ROX 參比熒光。

4.3 推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：

5. 結(jié)果分析判定

5.1結(jié)果分析條件設(shè)定

設(shè)置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機器自動分析的結(jié)果分析，當曲線出現(xiàn)整體傾斜時，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖動閾值線至高于陰性對照)，重新分析結(jié)果。

5.2結(jié)果判斷

FAM 通道為甲型流感病毒 H1N1 中 H1 基因檢測結(jié)果，ROX 通道為甲型流感病毒 H1N1 中 N1 基因檢測結(jié)果

陽性：檢測通道 Ct 值≤35.0，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線。

可疑：檢測通道 Ct 值>35.0，且出現(xiàn)明顯擴增曲線的樣本建議重復試驗，重復

試驗結(jié)果出現(xiàn) Ct 值≤35.0 和明顯擴增曲線者為陽性，否則為陰性。

陰性：樣本檢測結(jié)果無 Ct 值且無明顯的擴增曲線。

6. 檢測方法的局限性

Ø 樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運送以及保存質(zhì)量有關(guān)；

Ø 樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現(xiàn)假陽性結(jié)果；

Ø 陽性對照、擴增產(chǎn)物泄漏，會導致假陽性結(jié)果；

Ø 病原體在流行過程中基因突變、重組，會導致假陰性結(jié)果；

Ø 不同的提取方法存在提取效率差異，會導致假陰性結(jié)果；

Ø 試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或

定量檢測不準確的結(jié)果；

Ø 本檢測結(jié)果僅供參考，如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段。

7. 質(zhì)控標準

陰性質(zhì)控品：無明顯擴增曲線且無 Ct 值顯示；

陽性質(zhì)控品：擴增曲線有明顯指數(shù)生長期，且 Ct 值≤32；

以上條件應同時滿足，否則實驗視為無效。

【注意事項】

Ø 所有操作嚴格按照說明書進行；

Ø 試劑盒內(nèi)各種組分使用前應自然融化，*混勻并短暫離心；

Ø 反應液應避光保存；

Ø 反應中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

Ø 使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)工作服；

Ø 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進行，以免交叉污染；

Ø 實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；

Ø 試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學實驗室生物安全

通則》進行處理。

【參考文獻】

[1] 陳棋炯, 孫永祥, 丁軍, 等. 應用實時熒光定量 PCR 技術(shù)快速檢測甲型

H1N1 流感病毒[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志, 2010.

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Real-timePCR 法[S].

[3] 侯義宏, 王慧煜, 梅琳. 甲型 H1N1 流感病毒一步法多重 RT-PCR 檢測方法的

建立[J]. 動物檢疫學分會 2010 年學術(shù)年會論文集, 2010.

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