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RNA提取技術(shù)

更新日期: 2019-03-04
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細(xì)胞中的RNA可以分為信使RNA、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA和核糖體RNA三大類,不同組織總RNA提取的實(shí)質(zhì)就是將細(xì)胞裂解,釋放出RNA,并通過不同方式去除蛋白,DNA等雜質(zhì),終獲得高純度RNA產(chǎn)物的過程。

RNA提取技術(shù)流程

細(xì)胞裂解

異硫氰酸胍/苯酚法(TRIZOL)

這是一種傳統(tǒng)的RNA提取方法,適用于大部分動植物材料,但對于次生代謝產(chǎn)物較多的植物材料提取RNA效果較差。

該法應(yīng)用非常廣泛,適用于包括動物組織、微生物、培養(yǎng)細(xì)胞等在內(nèi)的各類動物性材料,同時(shí)還適用于次生代謝物較少的植物性材料,如幼苗、幼葉等。該法主要應(yīng)用在動物組織和培養(yǎng)細(xì)胞的RNA提取中。

胍鹽/β-巰基乙醇法

RNA提取技術(shù)適用于各種不同動物材料和次生代謝物少的植物材料。

在這種方法中,胍鹽使細(xì)胞充分裂解,β-巰基乙醇作為蛋白的變性劑在實(shí)驗(yàn)全程中可以抑制RNaseA的活性,保護(hù)RNA不被降解。

其它方法

有些植物材料多糖多酚含量較高,如植物果實(shí),番茄的葉子等,有些植物木質(zhì)化程度較高,如根莖等組織。針對這類材料本公司推出了一種全新的植物總RNA提取試劑,該試劑特別適合于從富含多糖、多酚、淀粉的材料中提取純度高、完整性好的總RNA,有關(guān)的具體步驟將在分論中詳細(xì)介紹,實(shí)驗(yàn)者可根據(jù)自己的需要進(jìn)行選擇。

1.樣品處理

從各種不同來源樣品(如細(xì)菌、酵母、血液、動物組織、植物組織和培養(yǎng)細(xì)胞),或同一來源樣品的不同組織(如植物幼嫩葉片、成熟根、莖等)中提取高質(zhì)量的RNA,因細(xì)胞結(jié)構(gòu)及所含的成分不同,樣品預(yù)處理的方式也各有差異。

樣品的要求

使用新鮮的樣品或取樣后立即在低溫(-20℃或-70℃)冷凍保存的樣品,避免反復(fù)凍融,因?yàn)檫@會導(dǎo)致提取的RNA降解和提取量下降。

樣品預(yù)處理方式

植物材料-液氮研磨

動物材料-勻漿、液氮研磨

細(xì)菌-溶菌酶破壁

酵母-液氮研磨、玻璃珠處理、混合酶破壁

硅基質(zhì)吸附法

隨著實(shí)驗(yàn)方法的改進(jìn),現(xiàn)已發(fā)展出一種采用吸附材料純化核酸的方法。目前較常見的有:硅基質(zhì)吸附材料、陰離子交換樹脂和磁珠等。硅基質(zhì)吸附材料因其具有可特異吸附核酸,使用方便、快捷、不使用有毒溶劑如苯酚等優(yōu)點(diǎn),成為核酸純化的S選。

 

RNA提取技術(shù)純化及獲得

純化要求

RNA樣品中不應(yīng)存在對酶(如逆轉(zhuǎn)錄酶)有抑制作用的有機(jī)溶劑和過高濃度的金屬離子。避免其它生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子的污染。排除DNA分子的污染。

純化方法及沉淀

方法一:有機(jī)溶劑抽提法

抽提

在使用RNA提取試劑進(jìn)行RNA提取時(shí),常使用進(jìn)行抽提,以去除蔗糖、蛋白等雜質(zhì),并促進(jìn)水相與有機(jī)相的分離,從而達(dá)到純化RNA的方法。在本公司的提取RNA的產(chǎn)品中,與TRIzol同型試劑法及其衍生試劑盒。

沉淀

抽提RNA后,一般采用了異丙醇或乙醇來沉淀水相RNA。加入0.6倍水相體積的異丙醇或與水相等體積的異丙醇,室溫沉淀20-30分鐘,高速離心,可獲得RNA沉淀。

溶解沉淀

加入適量RNase-free ddH2O溶解RNA沉淀。

纖維組織

心臟/骨骼肌等纖維組織提取RNA的關(guān)鍵在于*破碎組織。這些組織細(xì)胞密度低,單位重量的組織中RNA含量較低,建議增加起始量。此外,一定要在液氮中將組織*磨碎。

蛋白/脂肪含量較高的組織

腦或植物脂肪含量高,酚抽提后,上清含白色絮狀物。必須用再次對上清進(jìn)行抽提。

 

RNA提取技術(shù)純度檢測---分光光度計(jì)法

通過OD260/280來檢測RNA純度,OD260/230作為參考值。

OD260/280在1.9-2.1之間,可以認(rèn)為RNA的純度較好;

OD260/280值小于1.8,則表明蛋白雜質(zhì)較多;

OD260/280值大于2.2,則表明RNA已經(jīng)降解;

OD260/230值小于2.0,則表明裂解液中有異硫氰酸胍和β-巰基乙醇法殘留。

注意:如果用TE溶解或洗脫RNA,會使OD260/280值偏大。

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